32P-Postlabeling

Beim ³²P-Postlabeling handelt es sich um eine Methode zum Nachweis von DNA-Addukten.

Einzelschritt

Enzymatische Hydrolyse

Im ersten Schritt erfolgt eine enzymatische Hydrolyse der DNA mittels Nuklease und Phosphodiesterase. Als Produkte entstehen 3'-Monophosphate. Enthielt die DNA DNA-Addukte, so entsteht ein Gemisch aus Addukten und adduktfreien Nukleotiden.

Adduktanreicherung

Die Anreicherung ist fakultativ, erhöht jedoch die Empfindlichkeit. In einem zweiten Schritt spaltet eine selektive P1-Nuklease das 3'-Phosphat von den normalen Nukleotiden ab. Die durch Addukte modifizierten Nukleotide sind abbauresistent, so dass es zu einer Anreicherung kommt.

Alternativ ist es auch möglich, mittels n-Butanol-Extraktion die Addukte mit hydrophober Struktur zu extrahieren und somit anzureichern.

Phosphorylierung

Zur Markierung der Nukleotide wird durch T4-Polynukleotid-Kinase ein radioaktiver Phosphatrest von [γ-³²P]-ATP auf die Nukleotide im Ansatz übertragen. Es entstehen Desoxyribonukleosid-3'-[5'-³²P]-bisphosphate.

Trennung und Nachweis

Mittels mehrdimensionaler Dünnschichtchromatographie und Szintillation bzw. mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) kann nun der Nachweis erfolgen. Die Nachweisgrenze liegt bei 1 Addukt auf 10¹⁰ N.

Literatur

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