Benutzer:Lindahlh/USER fusion (Uracil Specific Excision Reagent)

Dieser Artikel ist im Entstehen und noch nicht Bestandteil der freien Enzyklopädie Wikipedia.

Solltest du über eine Suchmaschine darauf gestoßen sein, bedenke, dass der Text noch unvollständig sein und Fehler oder ungeprüfte Aussagen enthalten kann. Wenn du Fragen zum Thema hast, nimm Kontakt mit dem Autor Lindahlh auf.

Das Klonen mit Uracil Specific Excision Reagent (USER) ist eine benutzerfreundliche Klonierungsstrategie, die das Klonen von bis zu mehreren DNA-Fragmenten an spezifischen Positionen in einem Vektor in einem Schritt ermöglicht. Daher ist diese Klonierungsstrategie der klassischen auf Restriktionsenzymen und Ligasen basierenden Klonierung in Bezug auf Geschwindigkeit, Effizienz und Einfachheit überlegen.

Die Technik beruht auf Primern mit vektorspezifischen Überhängen, die eine einzelne Desoxyuridin-Base (Uracil) enthalten, die zur Amplifikation eines gewünschten DNA-Fragments in einer PCR-Reaktion verwendet wird. Das PCR-Fragment wird dann mit dem USER-Enzymgemisch (Uracil-DNA-Glykosylase und DNA-Glykosylase-Lyase Endo VIII) behandelt, um einzigartige 3'-Überhänge zu bilden, die komplementär zu den im Vektor vorhandenen 5'-Überhängen sind.

Um komplementäre Überhänge im Vektor bilden zu können, muss dieser eine USER-Kassette enthalten. Ein Beispiel für eine USER-Kassette ist eine PacI-Restriktionsstelle, die von zwei Nt.BbvCI-Nicking-Stellen flankiert wird. Durch Hinzufügen des Restriktionsenzyms PacI wird ein Doppelstrangbruch eingeführt, der, gefolgt von der Freisetzung von Nt.BbvCI 7 Basen stromabwärts der PacI-Stelle, einen 9bp langen 5'-Vektorüberhang bildet (Abbildung 1B). Dieser Überhang muss komplementär zu dem im PCR-Fragment gebildeten Überhang sein, damit eine Basenpaarung stattfinden kann. Die Basenpaarung zwischen den 9 komplementären Basen ist stabil genug, um den Vektor mit dem eingefügten Fragment in E. coli zu transformieren, wo das Plasmid durch das körpereigene DNA-Reparatursystem zusammen ligiert wird.