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Cas13

Cas13 (von CRISPR-associated) sind eine Klasse von Endonukleasen und somit Proteine, die als Ribonukleoproteine in der adaptiven Immunabwehr von Prokaryoten vorkommen. Sie finden molekularbiologische Anwendung bei der spezifischen Modifikation und Detektion von RNA und als antivirales Therapeutikum.[1][2]

Eigenschaften

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Cas13 gehört zu den Cas-Proteinen der Klasse 2 Typ VI, welche eine zentrale Rolle in der adaptiven Immunabwehr von Prokaryoten gegenüber Phagen spielen.[3] Initial entdeckt in 2017 sind bislang vier Subtypen bekannt.[4] Cas13a (vormals C2c2), Cas13b, Cas13c, und Cas13d. Beim Subtyp Cas13b werden zudem die Varianten Cas13b1 und Cas13b1 unterschieden.[5] Durch Inkorporierung spezifischer RNA-Moleküle, genannt CRISPR-RNA (crRNA), entsteht der Cas13-Effektorkomplex, der komplementäre Abschnitte der Phagen-RNA bindet und schneidet. Es handelt sich bei Cas13 folglich um RNA-vermittelte-RNA-bindende Nukleasen.[6] Die Spezifität entsteht durch eine 28–30 Nukleotide lange Sequenz innerhalb der crRNA, die als Spacer bezeichnet wird. Im Gegensatz zu Cas-Proteinen des Typs II (wie zum Beispiel Cas9), die ausschließlich Doppelstrang-DNA schneiden, benötigen sie keine Trans-activating crRNA (tracrRNA).[7] Die spezifische Bindung des Effektorkomplexes an die Zielsequenz führt bei einigen Cas13-Vertretern (zum Beispiel Cas13a) in Bakterien und in vitro zur Aktivierung einer unspezifischen Ribonuklease Aktivität.[8] Während DNA-bindende Cas-Proteine zur Bindung stets auf ein Protospacer Adjacent Motif (PAM) angewiesen sind,[9] benötigen einige Cas13-Proteine eine Protospacer Flanking Site (PFS) anstatt eines PAM. Diese PFS besteht bei Cas13a von Leptotrichia shahii aus einem beliebigen Nukleotid außer Guanosin.[10][7] Es wurde jedoch gezeigt, dass Cas13-Proteine anderer Spezies keine PFS zur Bindung benötigen.[11][12]

Anwendung

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Die Fähigkeit von Cas13-Proteinen, gezielt RNA-Sequenzen zu binden und zu schneiden, findet molekularbiologisch vielfältig Einsatz bei der Detektion von Viren und der Modifikation eukaryotischer mRNA.[1] Sie werden zudem experimentell als antivirales Therapeutikum genutzt.[2]

Detektion von Viren

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Cas13-Proteine können eingesetzt werden, um Viren auf Nukleinsäure-Niveau im attomolaren Bereich zu detektieren. Das hierzu entwickelte System heißt SHERLOCK als Akronym für „Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing“.[13][14] Das System wurde kürzlich adaptiert, um das SARS-CoV-2 in Patientenproben zu detektieren.[15] Das System wurde STOPCovid genannt (SHERLOCK Testing in One Pot) und arbeitet mit Cas12b.[16]

Therapeutische Anwendung

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Das CRISPR-Cas13-System zeigt in vitro zudem Potenzial als antivirales Therapeutikum. In einer ersten Studie konnte in mit SARS-CoV-2 infizierten humanen Zellen die Virus-RNA als auch die entsprechend transkribierte mRNA erfolgreich durch Cas13 degradiert werden.[2] Verwendet wurde hierfür Cas13d aus Ruminococcus flavefaciens, da diese Variante eine besonders hohe Aktivität in humanen Zellen aufweist.[17] Die Technologie wird von den Erfindern als „PAC-MAN“ bezeichnet (Prophylactic Antiviral CRISPR in huMAN cells). Mit der gleichen Strategie konnten zudem humane Zellen, die mit dem Influenza-A-Virus Typ H1N1 infiziert waren, erfolgreich behandelt werden.[2] Ein Vorteil der Technologie ist, dass ein zukünftiges Nachfolgesystem möglicherweise schnell an neuartige Viren angepasst und präventiv eingesetzt werden könnte.[18][19] Ebenfalls im März 2020 veröffentlichte ein anderes Forscherteam eine Open-source-Plattform für das Design von Cas13d-RNA-Zielsequenzen sowie optimierte Cas13-gRNAs für alle Protein-Vorlagen im menschlichen Genom.[20][21]

RNA-Modifikation in Eukaryoten

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Cas13a aus Leptotrichia wadei (LwaCas13a; vormals C2c2) wurde in Säuger- und Pflanzenzellen zur Inhibition der Genexpression durch Knock-down eingesetzt. In der gleichen Studie wurde eine katalytisch inaktive „Dead“-Version von Cas13a (dCas13a) zudem zur Detektion von mRNA in lebenden Zellen verwendet.[22] Durch Fusion von dCas13a mit der Adenosin-Desaminase-Domäne von ADAR2 konnten zudem in einer anderen Studie Nukleotide der mRNA von Säugerzellen gezielt modifiziert werden.[23] In weiteren Studien wurde gezeigt, dass bestimmte Orthologe von Cas13b und Cas13d eine höhere Aktivität in Säugerzellen aufweisen (PspCas13b aus Prevotella sp. P5-125 und RfxCas13d aus Ruminococcus flavefaciens). Die relativ zu anderen Cas13-Vertretern geringe Proteingröße von Cas13d erlaubt zudem die Verwendung in Adeno-assoziierten viralen Vektoren.[12][24] Cas13d wurde zudem in vivo zum Gen-Knock-down in Embryonen verschiedener Modellorganismen, wie Maus und Zebrabärbling, eingesetzt.[25]

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Einzelnachweise

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  1. ↑ a b Adrian Pickar-Oliver, Charles A. Gersbach: The next generation of CRISPR–Cas technologies and applications. In: Nature Reviews Molecular Cell Biology. Band 20, Nr. 8, August 2019, ISSN 1471-0072, S. 490–507, doi:10.1038/s41580-019-0131-5, PMID 31147612, PMC 7079207 (freier Volltext).
  2. ↑ a b c d Timothy R. Abbott, Girija Dhamdhere, Yanxia Liu, Xueqiu Lin, Laine Goudy: Development of CRISPR as an Antiviral Strategy to Combat SARS-CoV-2 and Influenza. In: Cell. Band 181, Nr. 4, Mai 2020, S. 865–876.e12, doi:10.1016/j.cell.2020.04.020, PMID 32353252, PMC 7189862 (freier Volltext).
  3. ↑ Sergey Shmakov, Aaron Smargon, David Scott, David Cox, Neena Pyzocha: Diversity and evolution of class 2 CRISPR–Cas systems. In: Nature Reviews Microbiology. Band 15, Nr. 3, März 2017, ISSN 1740-1526, S. 169–182, doi:10.1038/nrmicro.2016.184, PMID 28111461, PMC 5851899 (freier Volltext).
  4. ↑ Simon E Tröder, Branko Zevnik: History of genome editing: From meganucleases to CRISPR. In: Laboratory Animals. 23. Februar 2021, doi:10.1177/0023677221994613 (sagepub.com).
  5. ↑ Kira S. Makarova, Yuri I. Wolf, Jaime Iranzo, Sergey A. Shmakov, Omer S. Alkhnbashi: Evolutionary classification of CRISPR–Cas systems: a burst of class 2 and derived variants. In: Nature Reviews Microbiology. Band 18, Nr. 2, Februar 2020, ISSN 1740-1526, S. 67–83, doi:10.1038/s41579-019-0299-x.
  6. ↑ Lay, Martin,, Springer-Verlag GmbH: Genetik und Molekularbiologie. Berlin 2017, ISBN 978-3-662-50273-0.
  7. ↑ a b Kira S. Makarova, Feng Zhang, Eugene V. Koonin: SnapShot: Class 2 CRISPR-Cas Systems. In: Cell. Band 168, Nr. 1-2, Januar 2017, S. 328–328.e1, doi:10.1016/j.cell.2016.12.038 (elsevier.com).
  8. ↑ Alexandra East-Seletsky, Mitchell R. O’Connell, Spencer C. Knight, David Burstein, Jamie H. D. Cate: Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection. In: Nature. Band 538, Nr. 7624, Oktober 2016, ISSN 0028-0836, S. 270–273, doi:10.1038/nature19802, PMID 27669025, PMC 5576363 (freier Volltext).
  9. ↑ Mazhar Adli: The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. In: Nature Communications. Band 9, Nr. 1, Dezember 2018, ISSN 2041-1723, S. 1911, doi:10.1038/s41467-018-04252-2, PMID 29765029, PMC 5953931 (freier Volltext).
  10. ↑ Omar O. Abudayyeh, Jonathan S. Gootenberg, Silvana Konermann, Julia Joung, Ian M. Slaymaker: C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. In: Science. Band 353, Nr. 6299, 5. August 2016, ISSN 0036-8075, S. aaf5573, doi:10.1126/science.aaf5573, PMID 27256883, PMC 5127784 (freier Volltext).
  11. ↑ Omar O. Abudayyeh, Jonathan S. Gootenberg, Patrick Essletzbichler, Shuo Han, Julia Joung: RNA targeting with CRISPR–Cas13. In: Nature. Band 550, Nr. 7675, Oktober 2017, ISSN 0028-0836, S. 280–284, doi:10.1038/nature24049, PMID 28976959, PMC 5706658 (freier Volltext).
  12. ↑ a b David B. T. Cox, Jonathan S. Gootenberg, Omar O. Abudayyeh, Brian Franklin, Max J. Kellner: RNA editing with CRISPR-Cas13. In: Science. Band 358, Nr. 6366, 24. November 2017, ISSN 0036-8075, S. 1019–1027, doi:10.1126/science.aaq0180, PMID 29070703, PMC 5793859 (freier Volltext).
  13. ↑ Jonathan S. Gootenberg, Omar O. Abudayyeh, Jeong Wook Lee, Patrick Essletzbichler, Aaron J. Dy: Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. In: Science. Band 356, Nr. 6336, 28. April 2017, ISSN 0036-8075, S. 438–442, doi:10.1126/science.aam9321, PMID 28408723, PMC 5526198 (freier Volltext).
  14. ↑ Jonathan S. Gootenberg, Omar O. Abudayyeh, Max J. Kellner, Julia Joung, James J. Collins: Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. In: Science. Band 360, Nr. 6387, 27. April 2018, ISSN 0036-8075, S. 439–444, doi:10.1126/science.aaq0179, PMID 29449508, PMC 5961727 (freier Volltext).
  15. ↑ Julia Joung, Alim Ladha, Makoto Saito, Michael Segel, Robert Bruneau: Point-of-care testing for COVID-19 using SHERLOCK diagnostics. 8. Mai 2020, doi:10.1101/2020.05.04.20091231.
  16. ↑ STOPCovid. Archiviert vom Original (nicht mehr online verfügbar) am 10. Juni 2020; abgerufen am 19. Mai 2020 (englisch).
  17. ↑ Winston X. Yan, Shaorong Chong, Huaibin Zhang, Kira S. Makarova, Eugene V. Koonin: Cas13d Is a Compact RNA-Targeting Type VI CRISPR Effector Positively Modulated by a WYL-Domain-Containing Accessory Protein. In: Molecular Cell. Band 70, Nr. 2, April 2018, S. 327–339.e5, doi:10.1016/j.molcel.2018.02.028, PMID 29551514, PMC 5935466 (freier Volltext).
  18. ↑ Steven Levy: Could Crispr Be Humanity's Next Virus Killer? In: Wired. Abgerufen am 25. März 2020 (englisch).
  19. ↑ Can Crispr technology attack the coronavirus? | Bioengineering. In: bioengineering.stanford.edu. Abgerufen am 3. April 2020.
  20. ↑ New kind of CRISPR technology to target RNA, including RNA viruses like coronavirus In: phys.org. Abgerufen am 3. April 2020 (amerikanisches Englisch). 
  21. ↑ Hans-Hermann Wessels, Alejandro Méndez-Mancilla, Xinyi Guo, Mateusz Legut, Zharko Daniloski, Neville E. Sanjana: Massively parallel Cas13 screens reveal principles for guide RNA design. In: Nature Biotechnology. 16. März 2020, S. 1–6, doi:10.1038/s41587-020-0456-9, PMC 7294996 (freier Volltext).
  22. ↑ Omar O. Abudayyeh, Jonathan S. Gootenberg, Patrick Essletzbichler, Shuo Han, Julia Joung: RNA targeting with CRISPR–Cas13. In: Nature. Band 550, Nr. 7675, Oktober 2017, ISSN 0028-0836, S. 280–284, doi:10.1038/nature24049, PMID 28976959, PMC 5706658 (freier Volltext).
  23. ↑ David B. T. Cox, Jonathan S. Gootenberg, Omar O. Abudayyeh, Brian Franklin, Max J. Kellner: RNA editing with CRISPR-Cas13. In: Science. Band 358, Nr. 6366, 24. November 2017, ISSN 0036-8075, S. 1019–1027, doi:10.1126/science.aaq0180, PMID 29070703, PMC 5793859 (freier Volltext).
  24. ↑ Silvana Konermann, Peter Lotfy, Nicholas J. Brideau, Jennifer Oki, Maxim N. Shokhirev: Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors. In: Cell. Band 173, Nr. 3, April 2018, S. 665–676.e14, doi:10.1016/j.cell.2018.02.033, PMID 29551272, PMC 5910255 (freier Volltext).
  25. ↑ Gopal Kushawah, Luis Hernandez-Huertas, Joaquin Abugattas-Nuñez del Prado, Juan R. Martinez-Morales, Michelle L. DeVore: CRISPR-Cas13d Induces Efficient mRNA Knockdown in Animal Embryos. In: Developmental Cell. August 2020, S. S1534580720305876, doi:10.1016/j.devcel.2020.07.013 (elsevier.com).
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