Expressionsklonierung
Die Expressionsklonierung umfasst in der Genetik Methoden zur Identifikation unbekannter Gene anhand einer Eigenschaft oder Funktion der von ihnen exprimierten Proteine. Mittels Klonierung wird zuerst eine Genbibliothek in Vektoren generiert, die die Expression der DNA erlauben. Dabei codiert jeder Klon für maximal ein Protein. Diese Expressionsbibliothek wird nach einem Merkmal eines bestimmten Proteins, oder einer Gruppe von Proteinen abgesucht. Dieses Herausfiltern oder Suchen wird als Screening bezeichnet. Die so isolierten Klone werden dann weiter charakterisiert.
Prinzip
BearbeitenIn den meisten Fällen werden cDNAs untersucht und auf der Basis der Eigenschaften des von ihnen codierten Proteins isoliert. Zu diesem Zweck werden cDNAs von der mRNA des Organismus, des Gewebes, des Zelltyps, bzw. des Entwicklungsstadiums generiert, die die Isolierung der gewünschten cDNA wahrscheinlich machen, und in die Klonierungsstelle eines Expressionsvektors ligiert.
So entdeckten David Julius und Mitarbeiter durch die Expression von cDNA aus Spinalganglienzellen in HEK-Zellen den Capsaicin-Rezeptor, der die Antwort des Körpers auf unterschiedliche Reize wie Temperatur, Entzündung und andere Formen der Schädigung von Gewebe vermittelt.[1] Hierzu wurde der durch Capsaicin verursachte Kalziumeinstrom in sukzessive immer kleineren Pools nachgewiesen, bis ein einziger Klon, in diesem Fall die cDNA für den der TRPV1-Kanal, die Funktion vermittelte.
Eine weitere Methode setzt Pools von cDNA-Klonen in Vektoren ein, die eine in vitro-Transkription mit RNA-Polymerasen aus Bakteriophagen, wie der T7-RNA-Polymerase, erlauben.[2] Die RNAs werden nach Injektion in Oocyten des Krallenfrosches Xenopus laevis translatiert.[3] Die Oocyten werden auf Anwesenheit des gesuchten Proteins, z. B. einem Ionenkanal oder einem G-Protein-gekoppelten Rezeptors hin untersucht. Die positiven Pools werden in Subpools aufgetrennt, bis genau eine RNA den gewünschten Effekt hervorruft. Ein Beispiel für diese Strategie ist die Klonierung des ATP-Rezeptors.[4]
Viele der heute bekannten cDNAs wurden mittels des Bakteriophagen Lambda gt11-Expressionssystems charakterisiert. Der Bakteriophage Lambda erlaubt eine sehr dichte Ausplattierung auf einem E. coli-Bakterienrasen. Jeder Plaque entspricht einem Klon, der nach Induktion ein β-Galactosidase-Fusionsprotein generiert. Der Nachweis der Proteine gelingt nach Übertragung des Phagens auf einen Membranfilter (häufig Nitrocellulose), z. B. mittels eines Antikörpers gegen das zu untersuchende Protein oder, im Falle von Transkriptionsfaktoren, mit einer radioaktiv markierten doppelsträngigen DNA.[5][6][7]
Auch das Hefe-Zwei-Hybrid-System, das Hefe-Ein-Hybrid-System und das Phagen-Display werden zur Expressionsklonierung genutzt.[8]
Einzelnachweise
Bearbeiten- ↑ M. J. Caterina, M. A. Schumacher, M. Tominaga, T. A. Rosen, J. D. Levine, D. Julius: The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. In: Nature. Band 389, Nummer 6653, Oktober 1997, S. 816–824, doi:10.1038/39807, PMID 9349813.
- ↑ D. A. Melton, P. A. Krieg, M. R. Rebagliati, T. Maniatis, K. Zinn, M. R. Green: Efficient in vitro synthesis of biologically active RNA and RNA hybridization probes from plasmids containing a bacteriophage SP6 promoter. In: Nucleic acids research. Band 12, Nummer 18, September 1984, S. 7035–7056, PMID 6091052, PMC 320141 (freier Volltext).
- ↑ C. Z. Plautz, H. C. Williams, R. M. Grainger: Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System. In: Journal of visualized experiments : JoVE. Nummer 107, Januar 2016, S. e53518, doi:10.3791/53518, PMID 26862700.
- ↑ K. D. Lustig, A. K. Shiau, A. J. Brake, D. Julius: Expression cloning of an ATP receptor from mouse neuroblastoma cells. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 90, Nummer 11, Juni 1993, S. 5113–5117, PMID 7685114, PMC 46665 (freier Volltext).
- ↑ R. A. Young, R. W. Davis: Efficient isolation of genes by using antibody probes. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 80, Nummer 5, März 1983, S. 1194–1198, PMID 6219389, PMC 393560 (freier Volltext).
- ↑ C. Weinberger, S. M. Hollenberg, E. S. Ong, J. M. Harmon, S. T. Brower, J. Cidlowski, E. B. Thompson, M. G. Rosenfeld, R. M. Evans: Identification of human glucocorticoid receptor complementary DNA clones by epitope selection. In: Science. Band 228, Nummer 4700, Mai 1985, S. 740–742, doi:10.1126/science.2581314, PMID 2581314.
- ↑ Y. Ramanathan: Functional Cloning, Sorting, and Expression Profiling of Nucleic Acid-Binding Proteins. In: Genome Research. 12, S. 1175, doi:10.1101/gr.156002.
- ↑ J. L. Jestin: Functional cloning by phage display. In: Biochimie. Band 90, Nummer 9, September 2008, S. 1273–1278, doi:10.1016/j.biochi.2008.04.003, PMID 18466773 (Review).