Peptidmassenfingerprint
Ein Peptidmassenfingerprint (PMF) (engl. Protein-Fingerprinting) ist eine analytische Technik der Biochemie zur Identifizierung von Proteinen durch SDS-PAGE, Protease-Verdau und Massenspektrometrie. Der Peptidmassenfingerprint wurde im Jahr 1993 von mehreren Gruppen unabhängig voneinander entwickelt.[1][2][3][4][5]
Prinzip
BearbeitenBei diesem Verfahren wird ein noch unbekanntes Protein zunächst, meist mit der Protease Trypsin über einen In-Gel-Verdau, in kleinere Peptide verdaut, deren absolute Massen sehr genau mit einem Massenspektrometer, wie ein MALDI-TOF oder ein ESI-MS, gemessen werden können.[6] Diese gemessenen Massen werden anschließend entweder mit denen einer Datenbank wie Mascot für bekannte Proteinsequenzen oder auch mit denen einer Genomdatenbank verglichen. Dies wird durch die Verwendung von Computerprogrammen ermöglicht, welche die bekannten Genome der Organismen in Proteine übersetzen, diese Proteine dann theoretisch (in silico) in Peptide schneiden und dann die absoluten Massen der Peptide errechnen. Schließlich werden die gemessenen Massen der Peptide des unbekannten Proteins mit den theoretischen Peptidmassen verglichen und die Ergebnisse statistisch ausgewertet, um die beste Übereinstimmung zu finden.
Der Vorteil dieses Verfahrens ist, dass nur die Massen der Peptide bekannt sein müssen. Eine zeitraubende Proteinsequenzierung der Peptide ist dann nicht erforderlich. Von Nachteil ist, dass die gesuchte Proteinsequenz in einer Datenbank wie Mascot zu finden sein muss. Außerdem gehen die meisten Algorithmen für Peptimassenfingerprinte davon aus, dass die Peptide nur von einem einzigen Protein stammen.[7] Wenn ein Proteingemisch vorkommt, wird die Analyse erheblich erschwert und kann möglicherweise zu falschen Ergebnissen führen.
Wichtig für die Identifizierung von Proteinen durch einen Peptidmassenfingerprint ist also die vorherige Proteinreinigung. Mischungen von mehr als zwei bis drei Proteinen erfordern eine zusätzliche Verwendung von MS/MS-basierten Techniken zur Identifizierung von Proteinen, um eine ausreichende Spezifität der Identifizierung zu erreichen. Daher sind geeignete Proben für Peptidmassenfingerprinte aus 2D-Gelen geschnittene Proteinspots oder einzelne SDS-PAGE-Banden nach In-Gel-Verdau.[7][8][9]
Alternativen zum Peptidmassenfingerprint sind z. B. der Edman-Abbau oder ein Molekulares Display mit anschließender DNA-Sequenzierung.
Quellen
Bearbeiten- ↑ Pappin DJ, Hojrup P, Bleasby AJ: Rapid identification of proteins by peptide-mass fingerprinting. In: Curr. Biol. 3. Jahrgang, Nr. 6, 1993, S. 327–32, doi:10.1016/0960-9822(93)90195-T, PMID 15335725.
- ↑ Henzel WJ, Billeci TM, Stults JT, Wong SC, Grimley C, Watanabe C: Identifying proteins from two-dimensional gels by molecular mass searching of peptide fragments in protein sequence databases. In: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90. Jahrgang, Nr. 11, 1993, S. 5011–5, doi:10.1073/pnas.90.11.5011, PMID 8506346, PMC 46643 (freier Volltext), bibcode:1993PNAS...90.5011H.
- ↑ Mann M, Højrup P, Roepstorff P: Use of mass spectrometric molecular weight information to identify proteins in sequence databases. In: Biol. Mass Spectrom. 22. Jahrgang, Nr. 6, 1993, S. 338–45, doi:10.1002/bms.1200220605, PMID 8329463.
- ↑ James P, Quadroni M, Carafoli E, Gonnet G: Protein identification by mass profile fingerprinting. In: Biochem. Biophys. Res. Commun. 195. Jahrgang, Nr. 1, 1993, S. 58–64, doi:10.1006/bbrc.1993.2009, PMID 8363627.
- ↑ Yates JR, Speicher S, Griffin PR, Hunkapiller T: Peptide mass maps: a highly informative approach to protein identification. In: Anal. Biochem. 214. Jahrgang, Nr. 2, 1993, S. 397–408, doi:10.1006/abio.1993.1514, PMID 8109726.
- ↑ Clauser KR, Baker P, Burlingame AL: Role of accurate mass measurement (+/- 10 ppm) in protein identification strategies employing MS or MS/MS and database searching. In: Anal. Chem. 71. Jahrgang, Nr. 14, 1999, S. 2871–82, doi:10.1021/ac9810516, PMID 10424174.
- ↑ a b Shevchenko A, Jensen ON, Podtelejnikov AV, Sagliocco F, Wilm M, Vorm O, Mortensen P, Shevchenko A, Boucherie H, Mann M: Linking genome and proteome by mass spectrometry: large-scale identification of yeast proteins from two dimensional gels. In: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93. Jahrgang, Nr. 25, 1996, S. 14440–5, doi:10.1073/pnas.93.25.14440, PMID 8962070, PMC 26151 (freier Volltext), bibcode:1996PNAS...9314440S.
- ↑ Wang W, Sun J, Nimtz M, Deckwer WD, Zeng AP: Protein identification from two-dimensional gel electrophoresis analysis of Klebsiella pneumoniae by combined use of mass spectrometry data and raw genome sequences. In: Proteome Science. 1. Jahrgang, Nr. 1, 2003, S. 6, doi:10.1186/1477-5956-1-6, PMID 14653859, PMC 317362 (freier Volltext).
- ↑ Hufnagel P, Rabus R: Mass spectrometric identification of proteins in complex post-genomic projects. Soluble proteins of the metabolically versatile, denitrifying 'Aromatoleum' sp. strain EbN1. In: J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 11. Jahrgang, Nr. 1–2, 2006, S. 53–81, doi:10.1159/000092819, PMID 16825790.