Stoffel-Fragment
Als Stoffel-Fragment wird in der Biochemie eine veränderte DNA-Polymerase und somit ein DNA-erzeugendes Enzym bezeichnet.[1] Das Stoffel-Fragment basiert auf einer Taq-Polymerase und wird unter anderem in der Polymerasekettenreaktion zur Vervielfältigung von DNA eingesetzt. Der Name des Fragments leitet sich vom Namen der technischen Assistentin Susanne Stoffel ab, die es ab 1985 gemeinsam mit dem Biologen David Gelfand bei Cetus Corporation (heute Roche Molecular Systems) entwickelte.
Eigenschaften
BearbeitenDas Stoffel-Fragment ist eine durch Proteindesign modifizierte Taq-Polymerase und gehört somit zu den thermostabilen DNA-Polymerasen. Das Stoffel-Fragment ist eine Taq-Polymerase, bei der im Gen die 5'-3' Exonuklease-Funktion deletiert wurde. Beim Stoffel-Fragment fehlen die ersten 289 Aminosäuren.[2] Die Entfernung der in den ersten 289 Aminosäuren enthaltenen Exonukleasefunktion verdoppelt die Thermostabilität.[1] Aufgrund der deutlich niedrigeren Exonukleaseaktivität werden die erzeugten DNA-Stränge länger, weshalb das Stoffel-Fragment gelegentlich in einer Polymerasekettenreaktion zur Synthese längerer DNA-Sequenzen (ab zwei Kilobasen) verwendet wird. Weiterhin wird das Stoffel-Fragment in der qPCR verwendet, wenn eine Hydrolyse der Sonde unerwünscht ist (z. B. LightCycler-Sonden).[3] Meistens wird das Stoffel-Fragment rekombinant in Escherichia coli hergestellt.[4] Durch Insertion von Helix-Hairpin-Helix-Sequenzen kann die Stabilität gegenüber hohen Salzkonzentrationen erhöht werden.[5]
Einzelnachweise
Bearbeiten- ↑ a b F. C. Lawyer, S. Stoffel, R. K. Saiki, K. Myambo, R. Drummond, D. H. Gelfand: Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. In: The Journal of biological chemistry. Band 264, Nummer 11, April 1989, S. 6427–6437, PMID 2649500.
- ↑ S. Dabrowski, J. Kur: Recombinant His-tagged DNA polymerase. II. Cloning and purification of Thermus aquaticus recombinant DNA polymerase (Stoffel fragment). In: Acta biochimica Polonica. Band 45, Nummer 3, 1998, S. 661–667, PMID 9918492.
- ↑ J. Wilhelm, A. Pingoud, M. Hahn: Comparison between Taq DNA polymerase and its Stoffel fragment for quantitative real-time PCR with hybridization probes. In: BioTechniques. Band 30, Nummer 5, Mai 2001, S. 1052–6, 1058, 1060 passim, PMID 11355341.
- ↑ Z. Yang, Y. Ding, Y. Zhang, F. Liu: Rapid purification of truncated Taq DNA polymerase Stoffel fragment by boiling lysis of bacterial expression cultures. In: Biotechnology and applied biochemistry. Band 50, Pt 2Juni 2008, S. 71–75, doi:10.1042/BA20070114, PMID 18184110.
- ↑ A. R. Pavlov, G. I. Belova, S. A. Kozyavkin, A. I. Slesarev: Helix-hairpin-helix motifs confer salt resistance and processivity on chimeric DNA polymerases. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 99, Nummer 21, Oktober 2002, S. 13510–13515, doi:10.1073/pnas.202127199, PMID 12368475, PMC 129704 (freier Volltext).