Klenow-Fragment

Als Klenow-Fragment, auch Klenow-Enzym, wird das größere der beiden Proteinfragmente der DNA-Polymerase I aus Escherichia coli bezeichnet, die nach enzymatischer Spaltung mit Subtilisin entstehen. Es besitzt noch die 5'→3' Polymerase-Aktivität und die 3'→5' Exonuklease-Aktivität (proof reading), jedoch nicht mehr die 5'→3' Exonuklease-Aktivität der DNA-Polymerase I. Das Proteinfragment wurde erstmals 1970 von dem dänischen Biochemiker Hans Klenow beschrieben.^[1]

Verwendung

Das Klenow-Fragment wird in der Molekularbiologie für verschiedene Zwecke verwendet:

Synthese von doppelsträngiger DNA (Polymerasefunktion)
das Klenow-Fragment war das ursprüngliche Enzym^[2], welches für die Amplifizierung von DNA mittels PCR verwendet wurde, bevor es durch thermostabile DNA-Polymerasen, wie die Taq-Polymerase,^[3] ersetzt wurde. Das Klenow-Enzym ist nicht thermostabil und musste in jedem Zyklus erneut hinzugegeben werden.
Auffüllen von 5'-überstehenden, einzelsträngigen DNA-Sequenzen nach Restriktionen (Polymerasefunktion)
Abbau von 3'-überstehenden, einzelsträngigen DNA-Sequenzen nach Restriktionen (Exonukleasefunktion)

Diese Aktivitäten dienen nach dem Schneiden von DNA mit Restriktionsenzymen zur Herstellung von sogenannten blunt ends, die mittels T4-Ligase verbunden werden können (z. B. bei Klonierungen). Neben dem DNA-Template werden die 4 Nucleotidtriphosphate dGTP, dATP, dTTP und dCTP in der Magnesium-abhängigen Reaktion angeboten. Die Polymeraseaktivität dient auch der Markierung (engl. end labeling) von DNA-Fragmenten mit radioaktivem Phosphorisotop ³²P durch Ersatz eines dNTPs, beispielsweise dATP durch α-³²P-ATP und als Enzym beim Random Priming. Weitere Anwendungen sind die DNA-Sequenzierung mit der Didesoxymethode nach Sanger und die Zweitstrangsynthese bei der Klonierung von cDNAs.

Einzelnachweise

↑ Klenow, H. & Henningsen, I. (1970): Selective elimination of the exonuclease activity of the deoxyribonucleic acid polymerase from Escherichia coli B by limited proteolysis. In: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 65(1):168-175, PMID 4905667, PMC 286206 (freier Volltext).
↑ Saiki, R.K. et al. (1985): Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. In: Science. 230(4732):1350–1354, PMID 2999980.
↑ Saiki, R.K. et al. (1988): Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. In: Science. 239(4839):487-491, PMID 2448875.

[1] Klenow, H. & Henningsen, I. (1970): Selective elimination of the exonuclease activity of the deoxyribonucleic acid polymerase from Escherichia coli B by limited proteolysis. In: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 65(1):168-175, PMID 4905667, PMC 286206 (freier Volltext).

[2] Saiki, R.K. et al. (1985): Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. In: Science. 230(4732):1350–1354, PMID 2999980.

[3] Saiki, R.K. et al. (1988): Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. In: Science. 239(4839):487-491, PMID 2448875.

[1]

[2]

[3]